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01什么是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染？

簡(jiǎn)單說，就是把外源質(zhì)粒（比如帶熒光的載體）導(dǎo)入細(xì)胞，讓質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)臨時(shí)表達(dá)（通常24-72h達(dá)到峰值），不用整合到細(xì)胞基因組，主打一個(gè)“快速出結(jié)果”。

02哪些質(zhì)粒能做瞬時(shí)轉(zhuǎn)染？

不是所有質(zhì)粒都能瞬轉(zhuǎn)，重點(diǎn)看「真核表達(dá)元件」

常用瞬轉(zhuǎn)載體（直接用）：

熒光載體：pEGFP-N1/C1、pLVX-mCherry-C1、pIRES2-EGFP、pDsRed2-Mito通用載體：pcDNA3.1系列、pCMV-HA、pEF-GFP慢病毒載體（兼容瞬轉(zhuǎn)）：pLVX系列、pCDH系列（既能瞬轉(zhuǎn)，也能后續(xù)穩(wěn)轉(zhuǎn)）

不能瞬轉(zhuǎn)的載體：

pET、pGEX、pUC、pBlueScript等原核表達(dá)/克隆載體（沒有真核啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)進(jìn)去也不表達(dá)）

03實(shí)操重點(diǎn)

1. 細(xì)胞鋪板：轉(zhuǎn)染前24h鋪板，密度控制在70%-80%；2. 細(xì)胞換液：換成無抗生素培養(yǎng)（抗生素會(huì)影響細(xì)胞攝取質(zhì)粒），血清濃度在5%-10%的培養(yǎng)基。細(xì)胞狀態(tài)越好，轉(zhuǎn)染效率越高；3. 質(zhì)粒準(zhǔn)備：DNA量控制在2-6μg（黃金范圍）；4. 轉(zhuǎn)染液配制：注意輕柔配置；5. 轉(zhuǎn)染：將100μL轉(zhuǎn)染液和DNA復(fù)合物逐滴（1滴2-3s）加入孔板，輕輕搖勻；6. 換液：37℃、5%CO?孵育4-6h后，然后吸棄轉(zhuǎn)染液，PBS洗1次，換新鮮完全培養(yǎng)基；7. 熒光檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后24-48h熒光最強(qiáng)。

04高頻避坑指南（新手必看）

1.  無熒光/熒光弱？→ 大概率是HBS pH不準(zhǔn)（重新校準(zhǔn)到7.05-7.15），或質(zhì)粒不純（A260/A280≈1.8最佳），或細(xì)胞密度太低。

2.  細(xì)胞大量死亡？→①　孵育時(shí)間過長(zhǎng)、②　Ca2?濃度過高、③　細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好④　質(zhì)?？偭砍^6μg

解決方案：①　減少孵育時(shí)間至4h，②　降低DNA用量。③　此外，磷酸鈣轉(zhuǎn)染時(shí)，注意混合要緩慢滴加（1滴2-3s）,輕柔渦旋，再靜置15-20min，避免靜置時(shí)間過長(zhǎng)生成沉淀，難進(jìn)入細(xì)胞。

3.  雙標(biāo)只有一個(gè)亮？→ 質(zhì)粒比例失衡，調(diào)整兩個(gè)質(zhì)粒用量（1:1），確保兩個(gè)質(zhì)粒都能被細(xì)胞攝取。

05實(shí)驗(yàn)總結(jié)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的核心的是「細(xì)胞狀態(tài)+質(zhì)粒質(zhì)量+操作精度」，不用追求復(fù)雜試劑，磷酸鈣法低成本也能出好結(jié)果；雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)只要控制好總DNA量和比例，就能輕松實(shí)現(xiàn)。

明美活細(xì)胞成像儀MCS22的熒光效率模塊，應(yīng)用于熒光轉(zhuǎn)染分析：